工程院食品安全院士团队

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1.1菌株的采集

实验室用菌种一是到国家法定机构采购，二是购买商业派生菌种，三是科研中菌种交流。不管是哪种来源，均统一采集。采集中严格按照规范执行。要求包装可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保证菌种合格和环境安全。采集中要有菌种传代标识。选择有资质的标准菌株的合格供应商，每批标准菌株必须附带有供应商的合格证或检测报告或说明书，来证明所采购的标准菌株是合格的。

1.2标准菌株和验收

实验室收到标准菌株，首先应进行符合性感官检查，记录菌株号和标准菌株来源途径信息，确保溯源性清楚。同时还应记录标准菌株名称和数量、生产日期、接收日期和有无破损等情况。

1.3冻干标准菌株的复活

1.3.1开启产品包装：先用70%酒精棉擦拭外包装，再打开使用。

1.3.2复活：选择合适的培养基和培养条件（根据菌种使用说明书，见附录）进行复活。菌种的首次活化最好是在非选择性琼脂培养基上，除非特殊情况或特别推荐，一般不用液体培养基。冻干菌株的传代次数不得超过5代，从标准菌株保藏中心购买的冻干标准菌株为第F0代。

附录   冻干菌种的复苏培养和传代保存

注：培养基后面的数字编号为广东环凯微生物有限公司的产品编号，如需采购，请联系经销商或业务员。上表提供了菌种传代短期保存的方法，供参考。

1.4工作菌株确认方法及依据

用无菌接种环取上述培养物，在相应的培养基平板（营养琼脂、大豆胰蛋白胨琼脂）上或相应的细菌鉴别平板（如伊红美蓝、麦康凯、BP等上划线分离单个菌落，置适宜条件下培养（若该类微生物为厌氧菌，则培养条件应为厌氧条件）。以同样方法取真菌和酵母菌至SDA（萨布罗培养基）平板上或玫瑰红钠培养基平板上，23～28℃下培养7d；培养后观察是否具有典型的菌落状态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特征及菌体形态以确定菌种。

1.5 污染处理

假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯。要将

该污染培养物做灭菌处理，寻找原因，重新分离挑选纯菌落。

1.6菌种保存

所有菌种均由实验室专人(双人双锁)保存于专用冰箱或其它保存方式。要建立菌种登记台帐，详细记录菌种采集、保管、制备、使用、处置情况；每一种菌种一定要有检测鉴定报告（具体的的鉴定方法见菌种质量报告鉴定证书上的方法）；

具体菌种保存方法一般为：

将复苏后肉汤与灭菌甘油按15%甘油比例（肉汤8.5mL+甘油1.5mL）混合，-30 ℃冻存，（可用2mL冻存管冻存多管），作为保藏储备菌株F1代，也可使用商品化的菌种保存管。

1.7菌种的传代

1.7.1标准菌株的复苏：

① 菌种操作应在无菌条件下进行，防止杂菌污染。

② 每次使用和复苏时只需将小珠在平板上滚动或置肉汤中培养。

1.7.2标准储备菌株每转接一次须进行确认。（确认方法一般为他们各自独有的形态，在鉴别培养基上的形态）

1.7.3工作菌株转接的方法：

①、配制营养琼脂培养基（溶血性弧菌加3%氯化钠 ），121℃高压灭菌15分钟后分装在试管内，冷却后备用。

②、在无菌条件下，用接种环挑取菌苔至新鲜试管上作“米”字形划线接种，放置在36℃的培养箱内培养24小时。

1.7.4工作菌株的使用

1.7.4.1内部质量控制：一个月一次阳性对照、培养基每批验收；

1.7.4.2外部质量控制：能力验证、实验室比对；

1.7.5工作菌株的期间核查

1.7.5.1期间核查的频率：每半年对使用标准菌株进行一次期间核查。

1.7.5.2工作菌株期间核查的方法及依据：同工作菌株的确认一样。

1.7.5.3建立标准菌株期间核查记录。

1.8菌种的标识和使用期限：

1.8.1标识：菌种代数的计算为干粉菌种为第0代，转接一次加一代。具体标识为：例单增李斯特氏菌第0代，标识为DZ-0，第一代标识为DZ-01第一代有12支，则DZ-01-01、……、DZ-01-12；并标明日期：如2016.02.13这样填写。

1.9 菌种的保藏

1.9.1将试管内菌种放入冰箱中2～8℃冷藏保存。

1.9.2将传代并经过培养后的菌种放入冰箱中2～8℃保存。每支保存菌种需标明菌名、标准编号、传次、传代日期。

1.10菌种的销毁

1.10.1菌种使用后或超过贮存期的应进行销毁。

1.10.2需销毁的菌种，应用高压蒸汽（121℃）灭菌30分钟。

1.10.3灭菌后，再进行清洗和处理。

1.10.4销毁的菌种应做好记录。销毁时由化验负责人监督销毁，保管人员负责销毁。