工程院食品安全院士团队

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在微生物控制中，表面微生物总数可以作为评估生产过程中微生物污染风险的级别。微生物采样涉及医疗、食品卫生、制药工业、航空航天等各个领域，而物体表面微生物采样更是其中极重要的一个方面表面微生物取样相对比较困难，微生物附着在物体表面上，如果微生物采样方法不适合，很难检测到实际微生物数量。在实际微生物采样过程中物体表面的材质和粗糙度都有所不同，不同的污染媒介和微生物都会影响采样结果。

拭子采样法于 1997 年被作为定量和半定量表面微生物采样的标准方法，主要借助消毒拭子擦拭待检测表面，再转移到培养皿中进行培养；而新版 GMP 和药典中均提及接触皿采样法可作为表面微生物采样方法，本研究通过接触皿采样法、拭子采样法、淋洗采样法进行比较，评估了各采样法的采样效果，为接触皿采样法的应用提供借鉴。

材料与方法

1. 所需材料、试剂及仪器

金黄色葡萄球菌 ATCC6538

大肠埃希菌ATCC25922

枯草芽胞杆菌ATCC6633

铜绿假单胞菌 ATCC9027  

白色念珠菌ATCC10231

黑曲霉 ATCC16404

型培养箱、型菌落计数仪

316L 型不锈钢板

接触皿

胰酪大豆胨琼脂培养基( TSA)接触皿; 

沙氏葡萄糖琼脂培养基( SDA) 接触皿; 

营养琼脂培养基( NA) 接触皿

PH = 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液

2. 方法

2.1  菌悬液配制 

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌至胰酪 TSA 培养基斜面中，于 30 ℃ ～ 35 ℃ 培养 18 h ～ 24 h; 接种黑曲霉、白色念珠菌至 SDA 培养基斜面中，于 23 ℃ ～ 28 ℃培养 48 h ～72 h，上述培养物用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每0． 1 ml含菌数分别为1 cfu ～ 10 cfu 的低浓度菌悬液和50 cfu ～ 100 cfu 的高浓度菌悬液，并在 24 h 内使用。

2.2 菌种载体的制备 

取面积为 25 cm2 的 316L不锈钢板作为载体。载体于染菌前，应进行脱脂和灭菌处理。采用湿热灭菌法( 121 ℃，30 min) 对经过脱脂处理后的载体进行灭菌处理。将经灭菌的载体平铺于无菌平皿内，逐片滴加菌液，菌液滴加量每片为0.1 ml，将菌液均匀擦拭整个载体表面，滴染菌液后于层流台下吹干。

2.3 具体操作

将制备后的菌种载体分为 2 组，每组 3 片 ～ 5 片，分为取样检测组和实际活菌检测组，同时另取 3 片未染菌的载体做为阴性对照组。

取样检测组: 使用待评估的微生物取样方法对菌种载体微生物进行采样，制备供试液后检测各菌种载体上活菌数。

实际活菌检测组: 将菌种载体放入装有 100 ml 生理盐水的烧杯中，使用漩涡振荡器振荡 3 min 后，取出烧杯中的生理盐水作为供试液，采用薄膜过滤法在TSA( 细菌) 或 SDA( 霉菌) 90mm 平板培养基上培养，检测菌种载体上菌落数; 分别对 3 个菌种载体进行检测，以3 次检测结果的平均值作为菌种载体的实际活菌数。

阴性对照组: 将未染菌的载体放入装有 100 ml 生理盐水的烧杯中，使用漩涡振荡器振荡 3 min 后，取出烧杯中的生理盐水作为供试液，采用薄膜过滤法分别在 TSA及SDA90mm 平板培养基上培养，进行活菌计数，以 3 片未染菌的载体计数结果的平均值作为阴性对照结果。

接触皿采样法：

TSA、NA 和SDA 培养基接触皿( φ55 mm，面积为25 cm2 ) ，取下皿盖将培养基凸起面按压到采样物体表面5 s ～ 10 s 后，将皿拿起盖好皿盖，细菌置于30 ℃ ～ 35 ℃培养48 h，真菌于23 ℃ ～28 ℃培养72 h 观察计数。TSA 接触皿测试菌种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、黑曲霉、白色念珠菌; NA 接触皿测试菌种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌; SDA 接触皿测试菌种为黑曲霉、白色念珠菌。

淋洗采样法：

将20 ml 生理盐水缓缓倾注到装有菌种载体的平皿中，倾注时注意液体倾注点处于菌种载体中心位置，全部倾注后，将无菌平皿轻轻向上下左右各晃动5 次，晃动幅度大概在2 cm ～3 cm，之后使用移液枪将平皿中的生理盐水全部取出，作为供试液，取10 ml 进行活菌计数，采用薄膜过滤法，滤干后取出滤膜，细菌滤面朝上贴于TSA 90mm平板培养基和NA 90mm平板培养基上，真菌滤面朝上贴于SDA90mm平板培养基上，细菌置于30 ℃ ～ 35 ℃培养48 h，真菌于23 ℃ ～ 28 ℃培养72 h 观察计数。计数结果的2倍为淋洗取样活菌计数结果。

拭子采样法：

取无菌拭子，用无菌的0． 9%氯化钠溶液5 ml 浸湿，在取样点处选择约为25 cm2取样面上擦拭，完成后迅速将拭子放入无菌试管中并密封，加入10 ml 0． 9% 生理盐水，使用旋涡振荡器充分振荡后作为供试液，取5 ml 进行活菌计数采用薄膜过滤法过滤，滤干后取出滤膜，细菌滤面朝上贴于TSA90mm平板培养基和NA 90mm平板培养基上，真菌滤面朝上贴于SDA90mm 平板培养基上，细菌置于30 ℃ ～ 35 ℃ 培养48 h，真菌于23 ℃ ～ 28 ℃培养72 h 观察计数。计数结果的2 倍为擦拭取样活菌计数结果。

通过统计学处理，回收率以3 次实验测试值的平均值计，标准要求: 回收率≥70%。

结果

低含菌量和高含菌量的载体上TSA 接触皿、NA接触皿、SDA 接触皿采样，与淋洗采样和拭子采样比较，回收率差异均无统计学意义( P ＞ 0． 05) 。接触皿采样、淋洗采样、拭子采样在低含菌量( 1 cfu /25 cm2 ～ 10 cfu /25 cm2 ) 的物体表面的采样回收率高于在高含菌量( 50 cfu /25 cm2 ～100 cfu /25 cm2 ) 的物体表面的采样回收率，但均能达到70%以上。

结论

在食品药品企业生产车间，生产工具、仪器设备表面的微生物含量直接影响产品的最终质量，拭子采样法是一种较早用于表面微生物检测的方法，但是由于拭子检测法需要将拭子上的微生物转移至培养基中，不仅增加了检测步骤，而且容易在转移过程中产生假阳性。接触皿采样法作为一种表面微生物检测方法，不仅便于使用节省人力且对使用条件要求较低，例如不需要高压灭菌锅、超净台等，因此接触皿用于表面微生物的检测更加方便快捷。