微生物菌种传代与保藏
发布时间：2019-07-24 浏览次数：1241
一、菌种保藏的意义
菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的 生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种.微生 物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一项重要的基础工作， 是微生物学基础工作的一项重要内容，也是药品微生物工作中的一项常用技术。 如药品中的控制菌检查使用的阳性对照菌须防止因多次传代而使阳性对照菌的典型生物学 特征发生变化及菌株的死亡，保证达到菌种长期正确的形态； 如药品微生物学检验过程中，检出的可疑致病菌须妥善保藏，以达到进一步鉴定的目的，保 证用药安全。
二、菌种代号的意义
国内药品微生物检验所用的菌种代号是
CMCC（F）或 CMCC（B）
CMCC —— 中国医学菌种保藏中心
B —— 代表细菌，
F ——代表真菌。
大肠杆菌 [CMCC (B) 44102]
乙型副伤寒沙门杆菌 [CMCC (B) 50094]
铜绿假单胞菌 [CMCC (B)10104]
金黄色葡萄球菌 [CMCC (B)26003]
生孢梭菌[CMCC(B)64941]
白色念珠菌[CMCC(F)98001]
三、常用菌种保藏方法
(一) 菌种保藏的原理 根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度， 使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、 干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。因此，低温、干燥、真空是 用于菌种保藏的重要手段。 选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的 经济和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用,以提高保藏效果。
（二）菌种保藏步骤
① 挑选特征典型的纯菌菌落；
② 确定保藏的合适菌体形态；
③ 选择最适宜的保藏方法；
④ 定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满 应及时进行移种。
1. 琼脂斜面低温保存法
（1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培 养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮 纸保好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成 橡胶塞。放在 4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3 个月移种一次，继续进行保藏。若 用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年 ~ 一年。有的甚至更长时间。
（2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。
（3）特点： 优点是——简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都适用。 缺点是——保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。
（4）注意事项：
保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。
保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。
必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常 应及时处理。 每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续 保藏。 保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于 2 %为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。
铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。
2. 液体石蜡保存法：
本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。
（1）方法： 将菌种接种于斜面或穿刺于 0.3~ 0.5 %琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。 取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管 10~15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压 灭菌 30min，取出置 37℃温箱或 110~ 170 ℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干燥器内除去液体石蜡中的 水分。 将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端 1 ㎝为 宜，将试管直立，放入 4℃冰箱中保藏。 适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。
（2）液体石蜡对各类菌种保藏效果
（3）特点 本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，该法主要使菌种与空气隔绝。
（4）注意事项：
① 保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏。
② 保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移种。
③ 使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新 鲜斜面上培 养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上 即可使用。
④ 将沾有少量液体石蜡的接种针浸于 95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下 烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。
⑤ 液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使 保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面 1 ㎝为宜。
⑥ 制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。
