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《化妆品卫生规范》（2007年版）金黄色葡萄球菌检验
发布时间：2014-10-24 浏览次数：11061 分享：
1 范围 本规范规定了化妆品微生物学检验的基本要求。
本规范适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。
2 仪器和设备
2.1 天平。
2.2 高压灭菌器。
2.3 振荡器。
2.4 三角瓶，250mL。
2.5 玻璃珠。
2.6 玻璃棒。
2.7 刻度吸管，1mL、10mL。
2.8 研钵或均质器。
2.9 恒温水浴箱。
3 培养基和试剂
3.1 生理盐水
成分：
氯化钠 8.5g
蒸馏水加至1000mL
溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶 90mL，103.43kPa（121℃ 15 lb）20min
高压灭菌。
3.2 SCDLP 液体培养基
成分：
酪蛋白胨 17g
大豆蛋白胨 3g
氯化钠 5g
磷酸氢二钾 2.5g
葡萄糖 2.5g
卵磷脂 1g
吐温 80 7g
蒸馏水 1000mL
制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调 pH
为 7.2～7.3 分装，103.43kPa（121℃ 15 lb）20min 高压灭菌。注意振荡，使沉淀于底层的 吐温 80 充分混合，冷却至 25℃左右使用。
注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。
3.3 灭菌液体石蜡。
3.4 灭菌吐温 80。
3.5 7.5％的氯化钠肉汤
成分：
蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
氯化钠 75g
蒸馏水加至 1000mL
制法：将上述成分加热溶解，调 pH 为 7.4，分装，103.43kPa（121℃ 15 lb）15min 高 压灭菌。
3.6 Baird Parker 平板
成分：
胰蛋白胨 10g
牛肉膏 5g
酵母浸膏 1g
丙酮酸钠 10g
甘氨酸 12g
氯化锂（LiCl·6H2O） 5g
琼脂 20g
蒸馏水 950mL
pH7.0±0.2
增菌剂的配制：30％卵黄盐水 50mL 与除菌过滤的 1％亚碲酸钾溶液 10mL 混合，保存 于冰箱内。
制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至 25℃±1℃校正 pH。分装每瓶 95mL，103.43kPa（121℃ 15 lb）高压灭菌 15min。临用时加热溶化琼脂，每 95mL 加入 预热至 50℃左右的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5mL，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。 使用前在冰箱贮存不得超过 48h±2h。
3.7 血琼脂培养基
成分：
营养琼脂 100mL
脱纤维羊血（或兔血） 10mL
制法：将营养琼脂加热融化，待冷至 50℃左右无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀，制成 平板，置冰箱内备用。
3.8 甘露醇发酵培养基
成分：
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
甘露醇 10g
牛肉膏 5g
0.2％麝香草酚蓝溶液 12mL
蒸馏水 1000mL
制法：将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，调 pH7.4，加入甘露醇和 指示剂，混匀后分装试管中，68.95kPa（115℃ 10 lb）20min 灭菌备用。
3.9 兔（人）血浆制备
取 3.8％柠檬酸钠溶液，103.43kPa（121℃ 15 lb）30min 高压灭菌，1 份加兔（人）全血 4 份，混匀静置；2000rpm～3000rpm 离心 3min～5min。血球下沉，取上面血浆。
4 样品的采集及注意事项
4.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取 10g 或 10mL。包装量小于 20g
的样品，采样量可适当增加样品包装数量。
4.2 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防 止样品被污染。
4.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验， 样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。
4.4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品 做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。
4.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散， 所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作 规定进行。
4.6 如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。
5 供检样品的制备
5.1 液体样品
5.1.1水溶性的液体样品，可量取 10mL 加到 90mL 灭菌生理盐水中，如样品少于 10mL， 仍按 10 倍稀释法进行。如为 5mL 则加到 45mL 灭菌生理盐水，混匀后，制成 1：10 检液。
5.1.2油性液体样品，取样品 10mL，先加 5mL 灭菌液体石蜡混匀，再加 10mL灭菌的吐
温 80，在 40℃～44℃水浴中振荡混合 10min，加入灭菌的生理盐水 75mL（在 40℃～44℃ 水浴中预温），在 40℃～44℃水浴中乳化，制成 1：10 的悬液。
5.2 膏、霜、乳剂半固体状样品
5.2.1亲水性的样品：称取10g，加到装有玻璃珠及 90mL灭菌生理盐水的三角瓶中，充分 振荡混匀，静置 15min。用其上清液作为 1:10 的检液。
5.2.2疏水性样品：称取10g，放到灭菌的研钵中，加 10mL 灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状， 再加入 10mL 灭菌吐温 80，研磨待溶解后，加 70mL 灭菌生理盐水，在40℃～44℃水浴中 充分混合，制成 1：10 检液。
5.3 固体样品
称取 10g，加到 90mL 灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上 清液作为 1：10 的检液。
如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称 10g 样品加入 90mL灭菌生理盐水， 均质 1min～2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称 10g 样品，加 10mL灭菌液体石蜡，
10mL 吐温 80，70mL 灭菌生理盐水，均质 3min～5min。
6 操作步骤
6.1 增菌：取 1：10 稀释的样品接种到 90mL SCDLP 液体培养基中，置36℃±1℃培养箱， 培养 24h±2h。
注：如无此培养基也可用 7.5％氯化钠肉汤。
6.2 分离：自上述增菌培养液中，取 1～2 接种环，划线接种在Baird Parker 氏培养基，如 无此培养基也可划线接种到血琼脂平板，置36℃±1℃培养 24h～48h。在血琼脂平板上菌落 呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在 Baird Parker 氏培养基 上为圆形，光滑，凸起，湿润，直径为 2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周 围为一混浊带，在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到 非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置 36℃±1℃培养 24h±2h。
6.3 染色镜检：挑取分纯菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏 阳性菌，排列成葡萄状，无芽胞，无夹膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为 0.5m～1m。
6.4 甘露醇发酵试验：取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，在培养基液面上加入2mm～3mm的灭菌液体石蜡，置36℃±1℃培养 24h±2h，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇 产酸。
5.5 血浆凝固酶试验：吸取 1:4 新鲜血浆 0.5mL，放入灭菌小试管中，加入待检菌 24h±2h 肉汤培养物 0.5mL。混匀，放36℃±1℃恒温箱或恒温水浴中，每半小时观察一次，6h 之内 如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5mL，分别加入灭菌 1:4 血浆 0.5mL，混匀，作为对照。
6 检验结果报告 凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能
发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。
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图1：《化妆品卫生规范》（2007年版）金黄色葡萄球菌检验流程图
