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革兰氏染色法

（一）原理：

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

（二）器材

1、菌株：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）

2、染色液和试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、复红、二甲苯、香柏油

3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜

（三）革兰氏染色方法：

1、以酒精擦拭玻片，在酒精灯上干燥后，用接种环挑取一环灭菌的去离子水或生理盐水到载玻片上，挑取少量纯培养物在水滴上涂抺至均匀分散，将涂片在酒精灯火焰上灭活、固定。

2、滴加结晶紫染色液1-2 滴，染1 分钟，用去离子水轻轻水洗。

3、待干，滴加革兰氏碘液，作用1 分钟，用去离子水轻轻水洗。

4、滴洗脱色剂（95%酒精），不时摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约10～20 秒），用去离子水轻轻水洗。

5、待干，滴加沙黄复染液，复染30 秒。用去离子轻轻水洗，待玻片干燥后镜检。

6、油镜镜检。菌体呈紫色者为革兰氏阳性菌；呈红色者为革兰氏阴性菌。

（四）注意事项 

1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。 

2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 

3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

细菌芽孢染色法

（一）原理

细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。

（二）器材 

1.菌株：培养36小时的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）。 

2.染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液 3.器材：小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、滴管、玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。

（三）方法 

1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法 

（1）制备菌液：加1—2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。 

（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液2—3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 

（3）加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热15—20min。 

（4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。 

（5）固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。 

（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 

（7）复染：加蕃红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。 

（8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。 结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。

2.Schaeffer与Fulton氏染色法 

（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。 

（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2—3次。

（3）染色：

①加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持15-20min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。

②水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。 ③复染：用蕃红液染色5min。 （4）水洗、晾干或吸干。 （5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。。 结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。

（四）注意事项

1.供芽胞染色用的菌种应控制菌龄。 

2.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越，可优先使用。 

3.用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。

细菌的荚膜染色法

（一）原理

由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。

（二）器材

1.菌株：培养3-5天的胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”）。该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜丰厚。 

2.染色液和试剂 ：Tyler法染色液、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液、黑素、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。

3.器材： 载玻片、玻片搁架， 擦镜纸、显微镜等。

（三）方法 

推荐以下四种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。

1.负染色法： 

（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。 

（2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。 

（3）染色：在涂面上加复红染色液染色2—3min。 

（4）水洗：用水洗去复红染液。

（5）干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。 

（6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。 

（7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。 结果：背影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。

2.湿墨水法 

（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。 

（2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。 

（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。 

结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。

3.干墨水法 

（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。 

（2）制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。 

（3）干燥：空气中自然干燥。 

（4）固定：用甲醇浸没涂片，固定1 min，立即倾去甲醇。 

（5）干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。 

（6）染色：用甲基紫染1—2min。 

（7）水洗：用自来水轻洗，自然干燥。 

（8）镜检：先用低倍镜再高倍镜观察。 结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。

4.Tyler法 

（1）涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。 

（2）干燥：在空气中自然干燥。

（3）染色：用Tyler染色液染5—7min。 

（4）脱色：用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗2遍）。用吸水纸吸干，并立即加1—2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。 

（5）镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。 结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。

（四）注意事项

1.加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。

2.应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发热。 

3.在采用Tyler法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用20%CuSO4冲洗