微生物检测中常见的生物化学试验
发布时间：2019-11-04 浏览次数：842
一、糖类代谢试验
1.1 糖（醇）类发酵试验
不同细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。即使某些能发酵同样的糖（醇），但其产物也不同，有的产酸产气，有的产酸不产气，可根据这些特点来鉴别细菌。
大致可分为：
液体发酵管：无糖肉汤或蛋白胨水中，加入1%糖（醇）类指示剂，一支小玻管，经灭菌后备用。若被检细菌对营养要求较高时，则在试验前加入2%~5%无菌血清。
半固体发酵管：在液体糖（醇）发酵培养基中，加入0.3%~0.5%琼脂，溶化后分装试管，灭菌后让试管直立，使琼脂凝固，做成高层培养基，接种细菌应用接种针穿刺接种。
固体发酵管：此类培养基一般不常用，仅用于营养要求较高的某些细菌，在含糖类及5%~10%血清琼脂斜面上进行发酵试验。另外固体高层糖发酵管，可用于厌氧细菌糖发酵试验，如产气荚膜杆菌在含糖的固体高层发酵管中出现汹涌发酵（产生大量气体）。
双糖（或三糖）高层斜面发酵管：这种培养基含有葡萄糖和乳糖（或再加蔗糖），这两种糖（或三种糖）混在一起，制成高层斜面，其中葡萄糖和乳糖（或蔗糖）比例为1:10。
各种糖（醇）发酵管含糖（醇）的浓度，一般为0.5%~1%，有时可达2%。经121℃20~30min灭菌，容易水解变质，特别是在碱性溶液中更易破坏。
故糖（醇）发酵培养基常用高压蒸115℃15min灭菌。
应用的糖（醇）种类很多：
单糖：葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木胶糖、半乳糖；
双糖：乳糖、麦芽糖、蔗糖、覃糖；
多糖：菊糖、肝糖、糊精、淀粉；
醇：甘露醇、卫矛醇、山梨醇、侧金盏花醇、肌醇、丙三醇（甘油）；
糖苷：水杨苷等。
最常用的指示剂有酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫、酸性复红。
前两者颜色反应较敏感，但稳定性差，后二者比较稳定。特别是一些迟缓发酵的细菌，培养时间长，应用后二者指示剂。
酚红pH6.8（黄色）~pH8.4（红色）
1.2 甲基红试验（methyl red）
甲基红指示剂变色范围是pH4.4（红色）~pH6.2（黄色），产气肠杆菌分解葡萄糖产生丙酮酸，但又很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物质，则培养液的pH值仍在6.2以上，故此时加入甲基红指示剂，培养液呈黄色，此为阴性对照菌。阳性对照菌是大肠埃希氏菌，呈现红色为阳性。
1.3 V-P试验
伏-普试验，目的是检查细菌是否能分解葡萄糖，产生乙酰甲基甲醇。
阳性对照菌是产气肠杆菌，分解葡萄糖（被检细菌接种到葡萄糖蛋白胨水中，36℃18~24h）产生丙酮酸，再将丙酮酸脱羧形成乙酰甲基甲醇，在碱性条件下（乙液-40%KOH溶液），被氧化为二乙酰，与培养基蛋白胨中精氨酸等所含的胍基结合，通常在10min内形成红色化合物。
若不显色，放置于50℃水浴2h，或放置于37℃培养箱中4h，充分摇动，观察培养液反应结果，不显红色为阴性，阴性对照菌是大肠埃希氏菌。
1.4 ONPG试验
邻硝基酚-β-D-半乳糖苷的缩写，利用该试剂可以检查被检细菌有无β-半乳糖苷酶和渗透酶，发酵乳糖的细菌具有这两种酶。
渗透酶将乳糖分子带入菌细胞内，而β-半乳糖苷酶可将乳糖的β-半乳糖苷链切断，产生葡萄糖和半乳糖。
迟缓发酵乳糖的细菌，缺乏渗透酶，而ONPG渗入菌细胞内，被β-半乳糖苷酶分解产生邻位硝基苯酚，一般在20~30min内显黄色，为阳性，对照菌为枸橼酸盐杆菌和亚利桑那菌。
方法：将被检细菌接种到1%的乳糖肉汤琼脂培养基上，37℃培养过夜。取菌苔接种于0.25ml生理盐水中做成悬液。加入1滴甲苯，并充分振摇，使酶释放。在悬液中再加入ONPG液0.25ml，混匀，置于37℃培养箱或水浴箱中，分别在20min和3h后观察培养液反应结果不出现黄色者为阴性，对照菌是沙门氏菌。
1.5 氧化发酵试验
测定糖类的氧化或发酵及糖类未被利用的代谢类型。
氧化型：细菌在分解葡萄糖过程中，必须有氧分子参加。无氧环境中不能分解葡萄糖。
发酵型：在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。
产碱型：不分解葡萄糖的细菌。
将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡油，高度不少于1cm，37℃培养48h或更长，观察反应结果。
培养基变黄色为产酸。
两支培养基均产酸为发酵型细菌，仅不加石蜡的培养基产酸的是氧化型细菌，两支培养基均不变化的为产碱型细菌。
二、蛋白质、氨基酸及含氮化物代谢试验
2.1 苯丙氨酸脱氨酶试验
原理：某些细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，可使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与三氯化铁发生螯合作用，形成绿色络合物。
方法：将被检细菌的斜面培养物（先增菌）大量移种到苯丙氨酸琼脂斜面上，37℃培养18-24h，再从斜面上滴加10%三氯化铁溶液4-5滴，使其自斜面培养物上缓缓流下，观察结果。
结果：溶液出现绿色为阳性，对照菌是变形杆菌；不变色为阴性，对照菌是产气肠杆菌。
2.2 脱羧酶试验
原理：某些细菌具有某种氨基酸的脱羧酶，可使氨基酸脱去羧基产生胺和二氧化碳，胺使pH值>7，此时指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为蓝色。
溴麝香草酚蓝酸性显黄色，碱性显紫色。
方法：将被检细菌接种到两支脱羧酶培养基中，其中一支不加氨基酸，另一支加赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸，再在培养基上覆盖一层灭菌的液体石蜡，37℃培养18-24h，观察结果。
结果：两管培养基均含有葡萄糖，产酸，溴麝香草酚蓝由蓝变黄。含有氨基酸的一管出现脱羧基降解作用，产生碱性反应，溴麝香草酚蓝再由黄变蓝，为阳性。
鸟氨酸阴性对照菌为阴沟肠杆菌，显黄色。
2.3 靛基质（吲哚）试验
原理：某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质（吲哚），靛基质与对二甲氨基苯甲醛结合，形成玫瑰红色化合物。
方法：将被检细菌接种到胰蛋白胨水培养基中，37℃培养24-48h后，滴加数滴试剂于培养基液面，轻轻摇动（不可剧烈振动），观察结果。
结果：出现红色为阳性，对照菌是大肠埃希氏菌；出现黄色为阴性，对照菌是产气肠杆菌。
2.4 硫化氢试验
原理：某些细菌能分解含硫的氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐反应，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。
方法：将被检细菌以接种针穿刺接种于醋酸铅或双糖铁培养基（乳糖+葡萄糖）中，37℃培养24h，观察结果。
结果：有黑色出现为阳性。
说明：在硫化氢试验的培养基加入硫代硫酸钠的作用是还原作用，以保持培养基处于还原状态，是产生的硫化氢不被氧化。
产硫化氢较少的菌种可在试管口放置醋酸铅试条。
2.5 尿素酶试验
原理：某些细菌具有尿素酶，在含有尿素的培养基中，分解尿素产生氨，使培养基呈碱性，此时培养基中的酚红指示剂显红色。
方法：将被检细菌接种的尿素固体斜面培养基上，36℃培养4h检查一次，再每天检查一次，培养5天，观察结果。
结果：出现红色为阳性，对照菌为变形杆菌；变色为阴性，对照菌是大肠埃希氏菌。
三、枸橼酸盐利用试验
原理：枸橼酸盐培养基系一综合性培养基，其中枸橼酸钠为碳的唯一来源，磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的细菌能利用枸橼酸钠为碳源，能在培养基上生长，并且能分解枸橼酸盐，最后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用枸橼酸盐为碳源的细菌在该培养基上不生长，培养基不变色。
方法：将被检细菌的菌悬液（挑取菌苔后，洗至生理盐水中）接种到枸橼酸盐培养基上，37℃培养24h，观察结果。
结果：培养基上有菌生长，培养基变为深蓝色为阳性，对照菌是产气肠杆菌；若培养基不变色，则继续培养7天，培养基仍不变色者为阴性，对照菌为大肠杆菌。
四、呼吸酶类试验
4.1 氧化酶试验
原理：某些细菌具有氧化酶，能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺试剂氧化（先使细胞色素C氧化，电子传递体）成红色醌类化合物。
方法：取白色洁净滤纸蘸取待测菌落，加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴；Ewing氏改进法，再加α-萘酚溶液1滴。
结果：阳性者立即出现粉红色，并逐渐加深，变为淡紫色，再到深紫色，Ewing氏改进法阳性于0.5min内呈现鲜蓝色，对照菌为绿脓杆菌（铜绿假单细胞菌）；阴性者颜色无变化，Ewing氏法阴性为2min内不变色，对照菌为大肠杆菌。
1%盐酸二甲基对苯二胺溶液要避免接触含铁物质，防止出现假阳性反应。此试剂应少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，也可购置氧化酶试条。
该实验用于分辨革兰氏阴性杆菌中的肠杆菌科（阴性）与弧菌科（阳性）。
4.2 触酶活力试验
原理：具有触酶的细菌能催化过氧化酶，放出生态氧，继而形成氧分子，出现气泡。
方法：取3%过氧化氢0.5ml，滴加到不含血液的被检细菌琼脂培养物上，或滴加到不含血液的肉汤培养物中，观察结果。
结果：培养物出现气泡者为阳性。
说明：过氧化氢浓度过高（30%）会产生气泡出现假阳性；血液中含有触酶，容易出现假阳性。
4.3 硝酸盐还原试验
原理：某些细菌能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，再与α-萘胺结合，生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸（红色）。
方法：将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1~4天，每天吸取培养物2ml，加甲液（对氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸100ml）和乙液（α-萘胺0.5g，5mol/L醋酸100ml）各数滴，同时以为接种细菌的培养基作对照，观察结果。
结果：出现红色为阳性。
说明：亚硝酸盐在自然界分布很广，容易污染试剂，硝酸盐不纯或保管不妥也可能含有亚硝酸盐，因此必须做空白对照；繁殖迅速而还原硝酸盐能力强的细菌如果培养时间过久，可能将亚硝酸盐全部分解为氨和氮，出现假阴性反应，故需每天试验，空白对照。
五、毒性酶类试验
5.1 溶血试验
原理：某些细菌在代谢过程中，产生溶血素，能使人或动物的红细胞发生溶解。
方法：
1）平板法：将被检细菌接种到血液琼脂平板培养基上，37℃培养24h。
2）试管法：取被检细菌16-18h肉汤培养物若干，加等量经生理盐水洗涤三次的2%羊红细胞悬液，置于37℃水浴箱中，30min后观察结果。
结果：
1）平板法：若菌落周围出现透明的溶血环，为完全溶血（β溶血），菌落周围出现绿色溶血环，为不完全溶血（α溶血），无溶血环为不溶血（γ溶血）。
2）试管法：液体澄清透明为溶血，阳性。
5.2 链激酶试验
原理：A群链球菌在代谢过程中，产生链激酶，能激活血液中的纤维蛋白酶原为溶纤维蛋白酶，促使纤维蛋白凝块溶解。
方法：取血浆0.2ml，放入灭菌小试管中，加无菌生理盐水0.8ml，再加被检细菌18-24h肉汤培养物0.5ml，充分混匀后，再加入0.25%氯化钙水溶液0.25ml，置于37℃水浴中，观察结果。
结果：10min内血浆先凝固，而后又开始溶解，溶解时间与链激酶含量成正比。链激酶含量多时，20min内凝固的血浆完全溶解。如无变化，应在水浴中持续2h、24h，分别观察结果。血浆凝块完全溶解者为阳性，时间越短表明毒性越强。24h血凝块仍不溶解者为阴性。
5.3 血浆凝固酶试验
原理：某些细菌能产生血浆凝固酶，分两种，一种结合在细菌细胞壁上，遇到血浆直接作用于血浆的纤维蛋白，使细菌凝成颗粒状，使用玻片法；另一种分泌到细菌细胞外，称为游离血浆凝固酶，能使血浆中的纤维蛋白原变为纤维蛋白，使用试管法试验。
方法：
1）玻片法：取生理盐水2滴，分别滴于载玻片上，以接种环挑取被检细菌菌落，放在2滴生理盐水中，研磨成浓菌悬液。在1滴悬液中加1滴未稀释的血浆，另一滴加入1滴生理盐水作为对照，迅速摇动，观察结果。
2）试管法：取3支小试管，每支加1:4稀释的新鲜血浆0.5ml，其中1支加被检细菌生理盐水悬液或肉汤培养物0.5ml，另一支加阳性菌株生理盐水悬液或肉汤培养物0.5ml作阳性对照，再一支加生理盐水或肉汤培养液0.5ml作阴性对照。3支试管置于37℃水浴箱中，每隔30min观察一次结果。
结果：
1）玻片法：若在加血浆的1滴中迅速出现凝固颗粒，在加生理盐水对照的1滴中未出现凝固颗粒，为阳性；若超过2min才开始出现凝固颗粒者不作阳性（多为非致病性）。
2）试管法：6h内，若试验管和阳性对照管出现凝固，阴性对照管不出现凝固，为阳性；多数阳性细菌在0.5-1h内发生凝固。
六、嗜盐试验
原理：在高于3%的氯化钠培养基上不生长或生长不好，但能在无言培养基上生长的，称为非嗜盐菌，如肠杆菌科。能在3%-6%氯化钠培养基上生长，但在无盐培养基上不生长，称为嗜盐菌，如副溶血性弧菌。在无盐和高盐培养基上均能生长，但长得不茂盛，称为耐盐菌，如葡萄球菌、铜绿假单细胞菌。
方法：取被检细菌分别接种到1支无盐葡萄糖蛋白胨水和一支5%-6%氯化钠葡萄糖蛋白胨水中，37℃培养6-24h，观察生长情况。
结果：培养物出现浑浊生长为阳性。
